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原文題目：Hydrogen gas represses the progression of lung cancer via down-regulating CD47 (氫氣通過下調(diào)CD47抑制肺癌進(jìn)展)

發(fā)表年份：2020年

文獻(xiàn)來源：Bioscience Reports《生物科學(xué)報(bào)告》

作者單位：河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院呼吸科

背景介紹

肺癌是全球最常見且致死率最高的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌類型的約85%，其IV期患者的5年生存率不足1%。許多NSCLC患者在確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，因此迫切需要尋找新的有效干預(yù)策略。

氫氣（H?）作為一種內(nèi)源性氣體，不僅是一種能量來源，還具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等生理調(diào)節(jié)作用。早在1975年就有研究提出氫氣可能具有抗癌能力。本研究團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)氫氣能顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其分子機(jī)制尚不明確。

CD47是一種廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，通過抑制巨噬細(xì)胞吞噬作用介導(dǎo)“別吃我”信號。CD47在多種癌癥（包括NSCLC）中高表達(dá)，被認(rèn)為是癌癥干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。前期測序發(fā)現(xiàn)氫氣能降低肺癌A549細(xì)胞中CD47的表達(dá)，本研究旨在探索CD47在氫氣介導(dǎo)的肺癌抑制中的作用。

研究方法

1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)： 使用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975。

2. 氫氣處理：

使用上海納諾巴伯納米科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的氫氣發(fā)生器，讓細(xì)胞在含20%、40%、60% H?的環(huán)境中培養(yǎng)不同時(shí)間（通常48小時(shí)），以5% CO?環(huán)境作為對照。

3. 分子機(jī)制研究：

• 基因操作：使用質(zhì)粒過表達(dá)CD47 (OE-CD47) 或使用小干擾RNA敲低CD47 (si-CD47)，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照 (OE-NC, si-NC)。

• 分子檢測：使用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR) 分別檢測蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平。

4. 細(xì)胞功能檢測：

• 細(xì)胞增殖：使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (CCK-8) 檢測。

• 細(xì)胞侵襲：使用Transwell小室（包被Matrigel）檢測。

• 細(xì)胞遷移：使用傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測。

• 細(xì)胞凋亡：使用流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-FITC/PI染色）檢測。

5. 動物實(shí)驗(yàn)：

將A549細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)建立移植瘤模型。將荷瘤小鼠分為三組：氫氣組（每天吸入60% H? 2小時(shí)）、順鉑組（腹腔注射順鉑）、對照組（吸入空氣或注射生理鹽水）。干預(yù)持續(xù)4周后處死小鼠，收集腫瘤組織。

6. 巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)：

體外評估氫氣處理對巨噬細(xì)胞吞噬肺癌細(xì)胞能力的影響。

7. 組織學(xué)分析：

對小鼠腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色評估病理變化，并進(jìn)行免疫組化（IHC）染色檢測CD47和CDC42蛋白表達(dá)。

主要發(fā)現(xiàn)

1. 氫氣抑制肺癌細(xì)胞惡性行為：

60% H?處理顯著抑制了A549和H1975細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力（圖1A-E），并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（圖1F）；伴隨凋亡相關(guān)蛋白的變化：抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白cleaved caspase3/caspase3和cleaved PARP/PARP比值升高（圖1G）。

2. 氫氣下調(diào)CD47和CDC42表達(dá)：

H?處理顯著降低了A549和H1975細(xì)胞中CD47的mRNA和蛋白水平（圖2A,B）。并且，H?處理以劑量依賴的方式降低了CD47及其下游分子細(xì)胞分裂控制蛋白42（CDC42）的蛋白表達(dá)（圖2C,D）。

3. 敲低CD47增強(qiáng)氫氣抑癌效果：

敲低CD47 (si-CD47) 本身就能抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)凋亡。更重要的是，敲低CD47與H?處理聯(lián)合應(yīng)用，在抑制肺癌細(xì)胞惡性表型和誘導(dǎo)凋亡方面表現(xiàn)出比單獨(dú)處理更強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)（圖3B-H）。分子水平上，聯(lián)合處理導(dǎo)致Bcl-2和CDC42表達(dá)進(jìn)一步降低，cleaved caspase3/caspase3和cleaved PARP/PARP比值進(jìn)一步升高（圖3H）。

4. 過表達(dá)CD47削弱氫氣抑癌效果：

過表達(dá)CD47 (OE-CD47) 本身促進(jìn)了細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并抑制了凋亡。更重要的是，過表達(dá)CD47顯著削弱了H?處理在抑制細(xì)胞生長、遷移、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡方面的作用（圖4B-H）。分子水平上，過表達(dá)CD47逆轉(zhuǎn)了H?處理引起的凋亡相關(guān)蛋白變化（圖4H）。

5. 氫氣抑制體內(nèi)腫瘤進(jìn)展并下調(diào)CD47/CDC42：

在荷瘤小鼠模型中，吸入H?或注射順鉑均能顯著減輕腫瘤組織的病理損傷（細(xì)胞密度和異型性降低）（圖5A）。與對照組相比，H?組和順鉑組腫瘤組織中CD47和CDC42的表達(dá)均顯著降低（圖5B）。此外，H?處理顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的吞噬作用（圖5C）。

結(jié)論

本研究揭示了氫氣抑制肺癌進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制：氫氣通過下調(diào)跨膜蛋白CD47的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。CD47的下調(diào)不僅直接抑制了肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其凋亡，還通過解除CD47對巨噬細(xì)胞吞噬作用的抑制，增強(qiáng)了機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的清除能力（巨噬細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)）。CDC42作為CD47的下游效應(yīng)分子，其表達(dá)也受到氫氣的抑制。

這些發(fā)現(xiàn)為氫氣作為一種潛在、安全（本身毒性低）的肺癌干預(yù)策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。隨著氫氣療法在臨床試驗(yàn)中受到越來越多的關(guān)注，本研究支持將其作為一種有前景的癌癥干預(yù)方法進(jìn)行探索。

免責(zé)聲明：本研究為基礎(chǔ)科研論文，其發(fā)現(xiàn)與臨床應(yīng)用尚有距離。氫氣療法在人體中的安全性和有效性需通過嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。氫氣本身不是藥物，不能替代藥物治療疾病。